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動(dòng)物和人體的嗅覺系統(tǒng)已經(jīng)有了幾百萬年進(jìn)化的歷史,它能對(duì)大量不同的復(fù)雜氣味進(jìn)行辨識(shí)。人類嗅覺能夠識(shí)別和區(qū)分含量低至10-12級(jí)微量易揮發(fā)的不同分子結(jié)構(gòu)的化學(xué)物。到底是什么原因使嗅覺系統(tǒng)能對(duì)氣味進(jìn)行精確辨識(shí)一直是神經(jīng)信息學(xué)研究中的熱門課題之一[1]。長(zhǎng)期以來,由于嗅覺感受器位置的隱蔽性及其生理的特殊性造成了目前人工感覺系統(tǒng)的發(fā)展中人工嗅覺系統(tǒng)的開發(fā)水平遠(yuǎn)低于其它人工感覺系統(tǒng)。在嗅覺系統(tǒng)的研究中,其中具有代表性意義的是Axel和Buck世紀(jì)人才基金(NCET-06-0527)從1991年開始所從事的研究工作,在持續(xù)了10余年的研究后,其成果獲得了2004年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。這是人們從分子水平到細(xì)胞的組織方式上研究了嗅覺系統(tǒng),并闡述了嗅覺系統(tǒng)氣味識(shí)別在空間編碼上的識(shí)別機(jī)理。但是從時(shí)間編碼的角度來看,特別是嗅覺中樞信息處理的過程及相關(guān)的分子機(jī)制尚有很多方面有待更進(jìn)一步深入研究[2-3]。 目前,MEA成為系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中主要的工具[4-5]。MEA提供了一個(gè)樣本跨度從細(xì)胞水平到組織水平和生物系統(tǒng)水平的研究平臺(tái)。用微電極陣列能無損、快速、長(zhǎng)時(shí)間胞外同時(shí)記錄細(xì)胞群體的電活動(dòng)。神經(jīng)元群體發(fā)放模式往往攜帶有更為豐富和精確信息,有助于對(duì)神經(jīng)元群體編碼和信息傳遞過程進(jìn)行分析,即在網(wǎng)絡(luò)水平上研究神經(jīng)元自發(fā)時(shí)間和空間活動(dòng)模式[6]。MEA非常適合用于探測(cè)分離培養(yǎng)細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)或系統(tǒng)行為特性。它不僅可以記錄單個(gè)神經(jīng)元的響應(yīng)幅度的事件關(guān)聯(lián),更重要的是能記錄到沿神經(jīng)元分布的神經(jīng)沖動(dòng)的精確時(shí)間關(guān)聯(lián)。這種相關(guān)性分析,是神經(jīng)生物學(xué)研究中的重要工具。在研究神經(jīng)元連通性模型時(shí),時(shí)間相關(guān)分析可以作為功能解剖工具來判斷兩個(gè)神經(jīng)元是否存在相互作用的互動(dòng)調(diào)節(jié)。微電極同時(shí)記錄分布式神經(jīng)元活動(dòng)對(duì)于分析神經(jīng)元電發(fā)放的時(shí)空模式有指導(dǎo)性作用,可以揭示出神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的精確時(shí)間相關(guān)特性和放電模式的同步性。因此,分析多位點(diǎn)同時(shí)記錄的神經(jīng)元的時(shí)空關(guān)聯(lián),可以探測(cè)到沿著皮層網(wǎng)絡(luò)傳播的同步?jīng)_動(dòng)。通過對(duì)這種分布式神經(jīng)元放電的精確時(shí)間關(guān)聯(lián)編碼的分析,可以提供進(jìn)一步的線索來理解神經(jīng)信息處理的機(jī)理。MEA為神經(jīng)信息時(shí)空編碼的研究提供了有力的研究平臺(tái)[7]。 本文在MEA的芯片表面上研究了大鼠嗅覺系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法,制作了嗅球神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞芯片。通過72通道神經(jīng)信號(hào)接口調(diào)理電路和神經(jīng)信號(hào)同步采集系統(tǒng)[8],獲取了微電極陣列芯片上嗅球神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的神經(jīng)電生理信號(hào)。文中比較了不同培養(yǎng)時(shí)期神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)及其相應(yīng)的電生理信號(hào),并初步分析了嗅球神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理信號(hào)的復(fù)雜性。這個(gè)工作對(duì)基于MEA的嗅覺系統(tǒng)的時(shí)間編碼研究的平臺(tái)構(gòu)建做了初步的嘗試,并為下步即將開展的基于時(shí)間編碼和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的嗅覺系統(tǒng)生理建模的研究打下了良好的基礎(chǔ)。此外,通過文中大鼠全心離體心電信號(hào)采集和海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)自發(fā)放信號(hào)采集的實(shí)驗(yàn),文中建立的基于MEA的微電極陣列及其神經(jīng)信號(hào)采集分析系統(tǒng)的檢測(cè)平臺(tái)可廣泛適用于神經(jīng)細(xì)胞電生理和神經(jīng)生物學(xué)的研究。 方法 微電極陣列檢測(cè)技術(shù)原理和嗅球神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) MEA是在硅或者玻璃基底上采用標(biāo)準(zhǔn)硅工藝,并采用lift-off技術(shù)制作的微電極陣列,相對(duì)于FET的制作,其工藝較為簡(jiǎn)單。圖1所示的是平面微電極陣列及微電極位點(diǎn)在電鏡下的顯微圖結(jié)構(gòu)。電極可選用金、銥或鉑,直徑通常在幾個(gè)微米到幾十微米之間。本系統(tǒng)采用的是德國(guó)MCS公司生產(chǎn)的200/30iR-Ti-pr-T型號(hào)的微電極陣列芯片,該芯片具有60個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)。  
MEA預(yù)處理方法如下:親水處理和高壓滅菌處理后,用多聚賴氨酸涂層板,增加神經(jīng)細(xì)胞的貼壁性能。嗅球細(xì)胞提取與培養(yǎng)如下[9]: 1)取材:新生鼠(孕鼠15~17 d的胚胎)于無菌條件下取腦,剪開顱骨,快速取出完整大腦剝凈腦膜,取整個(gè)嗅球備用。2)洗滌:用PBS液(pH=7. 4,下同)清洗,離心1 000 g×3次,棄上清。3)機(jī)械解離:用眼科剪剪成小碎塊(0. 5 mm3左右)。4)消化: 0. 25%胰蛋白酶10 mL消化(37℃, 30 min),每隔10 min均勻振蕩,使組織塊變成疏松白色小塊,用吸管反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液后,用終止液終止消化過程,用200目篩網(wǎng)過濾。5)清洗: PBS液清洗,離心1 000 g×3次,棄上清。6)培養(yǎng):用含10μg/L的DMEM-10% FCS制備成單細(xì)胞懸液,按3×106個(gè)/mL的密度將細(xì)胞接種在事先用多聚賴氨酸涂層的MEA上,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~4 h后貼壁;每3 d換液。本文培養(yǎng)方法是在器件上培養(yǎng)一層細(xì)胞,讓它們隨機(jī)地生長(zhǎng),在細(xì)胞密度和陣列集成度都較大的情況下,保證一部分柵極上能生長(zhǎng)上細(xì)胞。 基于PCI和DSP多通道神經(jīng)信號(hào)刺激信號(hào)產(chǎn)生和采集系統(tǒng) 為了和微電極陣列芯片接口,采集芯片上細(xì)胞的動(dòng)作電位并對(duì)芯片上的電極產(chǎn)生刺激信號(hào),信號(hào)調(diào)理模塊要完成兩個(gè)功能:調(diào)理神經(jīng)信號(hào)使其在采集控制模塊的ADC輸入端得到理想輸入信號(hào);調(diào)理采集控制模塊的DAC輸出,產(chǎn)生刺激信號(hào)。人體的神經(jīng)電生理信號(hào)幅度一般從幾十μV到幾百μV,頻率的主要成分一般在幾個(gè)Hz到5 kHz之間。根據(jù)神經(jīng)信號(hào)以及神經(jīng)電極的接口特性,調(diào)理電路必須具備高共模抑制比、高輸入阻抗、低噪聲和低漂移。 本文以TI公司的TMS320VC5402和PLX公司的PCI9054為基礎(chǔ),開發(fā)設(shè)計(jì)了一種基于PCI和DSP結(jié)構(gòu)的多通道神經(jīng)信號(hào)采集系統(tǒng)(圖2),系統(tǒng)指標(biāo)如下: 1)通道電壓噪聲: <0. 6μVrms;2)通道數(shù):≤72; 3)采樣速率: 80 KSPS/channe;l4)采樣分辨率: 16位/channe;l 5)采樣模式:并行同步; 6)最高傳輸速度: 12 MB/s。同時(shí),為了對(duì)微電極陣列芯片產(chǎn)生刺激信號(hào),該系統(tǒng)提供4通道同步DAC刺激信號(hào)的產(chǎn)生,通過通道選擇,可以定位到任何一個(gè)位點(diǎn)。 結(jié)果 檢測(cè)系統(tǒng)的驗(yàn)證 為了驗(yàn)證系統(tǒng)的可靠性和可行性,本文設(shè)計(jì)并進(jìn)行了以下3個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)。 1)采用商用Cerebus128-ChannelDataAcqui-sition System (Cyberkinetics Inc. )配備的神經(jīng)電信號(hào)模擬發(fā)生器和信號(hào)采集系統(tǒng),對(duì)比測(cè)試本系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本系統(tǒng)采集的數(shù)據(jù)波形如圖4所示。圖4中的上圖是長(zhǎng)時(shí)間采集的模擬信號(hào)波形,波形中的梅花波用以模擬低頻成分的LFP信號(hào),而中間夾雜的較高頻率的尖峰信號(hào)用以模擬APs信號(hào),圖4中的下圖是局部信號(hào)的放大,可以明顯看到Spike信號(hào)疊加在低頻場(chǎng)電位信號(hào)上。本系統(tǒng)測(cè)試結(jié)果與Cerebus系統(tǒng)一致。 
2)借鑒國(guó)外商用MEA測(cè)試系統(tǒng)產(chǎn)品培訓(xùn)的做法,采用離體心臟來測(cè)試整體系統(tǒng)的性能。該方法能在合適條件下可肉眼觀察離體心臟的搏動(dòng),伴隨著這種搏動(dòng)會(huì)有同步心電信號(hào)的出現(xiàn)。因此,本系統(tǒng)采用新生大鼠全心離體的心電信號(hào)采集實(shí)驗(yàn),初步驗(yàn)證微電極陣列以及神經(jīng)信號(hào)采集系統(tǒng)的可行性。具體的實(shí)驗(yàn)方法如下: 1)取材:大鼠新生鼠; 2)將新生鼠斷頭,用眼科剪和眼科鑷分離心臟,用37℃溫浴的臺(tái)式液灌流,清除血液; 3)迅速將離體心臟置于多通道電極陣列(MEA)上,保持灌流液溫度。在這種條件下,小鼠離體心臟可以維持0. 5~1 h左右的時(shí)間搏動(dòng),具體時(shí)間視實(shí)驗(yàn)情況而異。將離體新生大鼠的整個(gè)心臟放在MEA的培養(yǎng)皿中,如圖3所示。開啟多通道信號(hào)采集系統(tǒng)進(jìn)行離體心電信號(hào)的采集,對(duì)其中一個(gè)通道進(jìn)行連續(xù)采集得到的心電波形如圖5中的上圖所示。局部放大后其中一個(gè)的ECG信號(hào)如圖5中的下圖所示。 
3)海馬區(qū)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的培養(yǎng)和測(cè)試。由于目前人們將MEA應(yīng)用于海馬區(qū)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的研究較為普遍[10],為了進(jìn)一步驗(yàn)證本系統(tǒng)的工作性能,我們也記錄了培養(yǎng)2周后的海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的多通道自發(fā)放信號(hào)(圖6)。上圖是其中一個(gè)通道連續(xù)5 s采樣記錄的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),下圖是上圖通道局部放大后的海馬神經(jīng)元的Spike信號(hào)發(fā)放信號(hào),從中可見神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粠追N典型的發(fā)放波形,采用葉學(xué)松等[11]的分類方法可得到明顯的分類效果。多通道同步記錄的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見圖10。 嗅球神經(jīng)細(xì)胞在MEA上的培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖和代謝等生理性質(zhì),在很大程度上受各種環(huán)境因素的影響。而影響動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖的環(huán)境因素有很多,主要有溫度、pH、營(yíng)養(yǎng)成分、溶氧及氣體環(huán)境、滲透壓及其它因素等方面。溫度是細(xì)胞在體外生存的基本條件之一,人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞最適宜的溫度為37℃。細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比,偏高于此溫度范圍,細(xì)胞的正常代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響,甚至導(dǎo)致死亡。合適的pH也是細(xì)胞生存的必要條件之一,動(dòng)物細(xì)胞合適的pH值一般在7. 2~7. 4,低于6. 8或高于7. 6都對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞退變或死亡。不細(xì)胞對(duì)pH也有不同要求:原代培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)pH變動(dòng)耐受性差,傳代細(xì)胞系耐受性較強(qiáng)。對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來說,偏酸性環(huán)境比堿性環(huán)境更利于生長(zhǎng)。對(duì)MEA進(jìn)行預(yù)處理后,在MEA上培養(yǎng)嗅球神經(jīng)元若干天后,得到發(fā)育較好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。嗅覺神經(jīng)芯片的觀察和操作系統(tǒng)由LeicaDM2500和EppendorfTransferManNK2構(gòu)成,如圖7所示。培養(yǎng)4 d后的嗅球神經(jīng)元已出現(xiàn)互相連接,并逐漸形成網(wǎng)絡(luò)的現(xiàn)象;培養(yǎng)10 d后的嗅球神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)則更加密集,結(jié)果如圖8所示。 
嗅球神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)動(dòng)作電位的同步檢測(cè)及活性判斷 我們分別記錄了嗅球神經(jīng)芯片上培養(yǎng)了4 d和10 d后的神經(jīng)元發(fā)放電信號(hào),系統(tǒng)采樣頻率設(shè)置在50 kSPS/channel。60個(gè)通道的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表明,培養(yǎng)了4 d的芯片基本上未見明顯的神經(jīng)電活動(dòng)現(xiàn)象。圖9中的上圖和下圖分別為其中一個(gè)通道4 d和10 d后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過比較采集到的不同培養(yǎng)天數(shù)的神經(jīng)元發(fā)放信號(hào)可以看出,培養(yǎng)10 d后采集到的嗅球神經(jīng)信號(hào)較4 d后采集到的信號(hào)在信號(hào)發(fā)放幅度上有明顯的提高。對(duì)圖10中第4通道神經(jīng)元的發(fā)放進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì),在1. 8 s時(shí)間內(nèi),神經(jīng)元的發(fā)放次數(shù)為77個(gè)。我們對(duì)來自芯片的60個(gè)通道的記錄信號(hào)在時(shí)域和頻域上進(jìn)行檢測(cè)分析和Spike信號(hào)的提取。哺乳動(dòng)物嗅球的神經(jīng)細(xì)胞比較復(fù)雜,由僧帽細(xì)胞(mitralcell)、簇細(xì)胞( tufted cell)、顆粒細(xì)胞(granularcell)及球旁細(xì)胞(periglomerular cell)等典型細(xì)胞構(gòu)成了嗅球內(nèi)一整套完整的氣味信號(hào)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)系統(tǒng)。根據(jù)動(dòng)物嗅球神經(jīng)細(xì)胞電生理仿真模型計(jì)算所得的神經(jīng)細(xì)胞放電特性[12-13],本文選取了具有幾個(gè)較具代表意義的通道信號(hào),如圖10所示。其中具有低頻能量分布的1、2通道和具有高頻能量分布的3、4通道在頻譜的結(jié)構(gòu)上有明顯的同。這些不同的信號(hào)特征代表了哺乳動(dòng)物嗅球系統(tǒng)中復(fù)雜的電生理現(xiàn)象。  
根據(jù)以上結(jié)果,針對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)期的嗅球細(xì)胞,可以通過3個(gè)方面進(jìn)行活性的判斷。首先光鏡觀測(cè)嗅球網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)及其互相連接,并逐漸形成網(wǎng)絡(luò)的過程,形成直觀的判斷。其次針對(duì)不同培養(yǎng)階段的狀態(tài),通過神經(jīng)電生理信號(hào)的檢測(cè)并分析其實(shí)際的網(wǎng)絡(luò)電活動(dòng)特征。例如spike發(fā)放的強(qiáng)度以及位置。聯(lián)合這兩個(gè)方面的演化過程信息,還可以進(jìn)一步通過光鏡下的細(xì)胞操縱來獲得時(shí)空關(guān)系上的活性特點(diǎn)進(jìn)行判斷。最后通過電或者化學(xué)氣味的刺激來獲得嗅覺神經(jīng)芯片實(shí)際的性能。由于其性能與嗅球神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的活性密切相關(guān),顯然也可以成為判斷活性的重要依據(jù)。至于刺激實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)將會(huì)成為未來工作的一個(gè)重要方向。 嗅覺神經(jīng)芯片的使用 為了在MEA上得到較為簡(jiǎn)單的嗅覺系統(tǒng)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),在接下來的工作中,我們將利用具有相對(duì)簡(jiǎn)單的嗅覺系統(tǒng)的動(dòng)物并制作相應(yīng)的嗅覺芯片,使其在空間和形態(tài)上具有可分性。此外,我們將控制神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的密度以及通過相應(yīng)的儀器設(shè)備控制細(xì)胞的生長(zhǎng)位點(diǎn),通過觀察神經(jīng)芯片上細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),相應(yīng)地獲得較為接近實(shí)際的網(wǎng)絡(luò)模型。通過本系統(tǒng)的電刺激信號(hào)或化學(xué)刺激信號(hào)作用于相對(duì)的神經(jīng)位點(diǎn),研究嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)過程。同時(shí),通過向芯片中加入神經(jīng)遞質(zhì)受體的拮抗劑,如荷包牡丹堿(bicuculline)、雙氫-β-刺酮酊(DH-β-E)等,研究這種化學(xué)物質(zhì)對(duì)嗅覺系統(tǒng)時(shí)空編碼的影響。目前我們已經(jīng)完成了具有簡(jiǎn)單嗅覺系統(tǒng)(如蝗蟲觸角)以及完整動(dòng)物嗅球電生理多室動(dòng)力學(xué)模型的建立。如何將嗅覺系統(tǒng)的仿真模型及編碼研究和實(shí)際的測(cè)量對(duì)應(yīng)將是未來工作的重點(diǎn)。 結(jié)論 本文基于MEA構(gòu)建的嗅覺神經(jīng)芯片及其測(cè)試系統(tǒng)能夠成功地獲取芯片上不同培養(yǎng)時(shí)期嗅球神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的神經(jīng)電生理信號(hào),為分析嗅球神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)電生理信號(hào)的復(fù)雜性和嗅覺系統(tǒng)時(shí)間編碼的研究工作提供了必要的數(shù)據(jù)以及初步系統(tǒng)平臺(tái),從而為下步即將開展的基于時(shí)間編碼和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的嗅覺系統(tǒng)生理建模的研究打下了良好的基礎(chǔ)。同時(shí),本工作建立的基于MEA及其神經(jīng)信號(hào)采集分析系統(tǒng)的檢測(cè)平臺(tái)同樣可廣泛適合于神經(jīng)細(xì)胞電生理和神經(jīng)生物學(xué)的研究。 摘自：中國(guó)計(jì)量測(cè)控網(wǎng)
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